인간 배아 발생을 위한 모델로서의 다능성 줄기 세포. (2023)

저자(들): Daniela Avila-Gonzalez [1,2]; Mikel Angel Gidi-Grenat [2]; 과달루페 가르시아-로페즈 [2]; 알렉산더 마르티네즈-후아레즈 [2]; Anayansi Molina-Hernandez [2]; 웬디 포르티요 [3]; Nestor Emmanuel Diaz-Martinez(교신저자)[1,*]; Nestor Fabian Diaz(교신저자) [2,*]

1. 소개

발달 생물학은 정확한 시간-공간 패턴과 살아있는 유기체가 생성되는 방식을 결정하기 위해 배아 발생 및 형태 형성 및 상호 작용 동안 세포 과정을 제어하는 ​​분자 메커니즘을 해독해야 하는 과제를 안고 있습니다. 이 분야의 첫 번째 이정표는 1세기 이상 전에 Hans Spemann과 그의 제자 Hilda Mangold가 수행한 양서류 배아(Triturus 속)에 대한 실험이었습니다. 그들은 초기 낭배 단계에서 특정 계통의 형성과 배아 축을 지시할 수 있는 세포 영역을 설명했습니다. 따라서 현재 Spemann-Mangold 조직자라고 불리는 발견은 유도, 사양, 경쟁 및 분화와 같은 발생 생물학의 필수 개념을 정의하는 실험 및 비교 발생학의 기둥 중 하나였습니다. 지난 30년 동안 유전자 표지를 통해 세포 계통을 추적하거나 발달 중 유전자 손실의 영향을 분석(녹아웃)하기 위해 다양한 척추 동물을 유전적으로 변형(유전자 변형 모델)하는 새로운 실험적 접근 방식이 증가했습니다. 생체 내 및 시험관 내 시스템의 데이터를 대조하기 위한 최신 도구 중 하나는 유기체의 모든 세포 유형으로 자체 재생 및 분화할 수 있는 미분화 집단인 만능 줄기 세포(PSC)를 사용하는 것입니다. 따라서 발달 생물학적 과정의 기초가 되는 중요한 분자 메커니즘을 밝히고 척추동물 배아 발생을 이해하기 위해 이를 외삽하는 것이 가능합니다.

영장류와 쥐의 배아 발달 사이의 유사성에도 불구하고 시기와 공간에는 눈에 띄는 차이가 있습니다. 예를 들어, 영장류의 만능성은 쥐 모델보다 더 오래 지속됩니다[1]. 인간 외배엽은 또한 비배아 계통(영양 외배엽 또는 하배엽)으로 발달할 수 있지만, 이 능력은 마우스에서 더 제한됩니다[2,3]. 더욱이 배외 중배엽과 양막 상피 혈통이 영장류에 착상되는 동안 발생하지만, 이 과정은 설치류 종에서는 낭배 형성까지만 발생합니다[4]. 한편, 마카카(Macaca) 및 칼리트릭스(Callithrix) 배아는 인간을 포함하여 분화 및 발달을 연구하기 위한 영장류 모델로 일반적으로 사용됩니다. 그러나 영장류 배아의 제한된 가용성, 기술적 문제, 윤리적 문제 및 착상 전후 단계 연구의 어려움으로 인해 인간 배아 발달에 대한 이해가 부족했습니다.

예외적으로, 연구자들은 시험관 내에서 정의된 플랫폼을 사용하여 이식 및 위배 형성을 시뮬레이션하여 생체 외 인간 배아 연구에서 중요한 이정표에 도달했습니다[5,6,7]. 그러나 실험실에서 배아를 일상적으로 사용하는 것은 배아의 도덕적 지위에 관한 지역 및 국제법과 대중의 판단으로 인해 실현 가능하지 않습니다. 언급한 바와 같이 인간 PSC(hPSC)는 배아 세포가 무엇을 할 수 있는지, 발달 중 특정 시간 창에서 어떻게 하는지 명령하는 규칙을 발견하는 데 유용한 모델입니다. 실제로 hPSC에서 파생된 3차원(3D) 구조는 배반포 또는 양막 형성 또는 대칭 파괴와 같은 특정 프로세스를 모방하여 초기 인간 배아 발생에 대한 새롭고 유용한 정보를 제공할 수 있습니다.

여기에서 우리는 다분화능, hPSC 계통 유도, 배아 및 배아외 잠재력에 초점을 맞춰 배반포 단계와 형태 형성 시작 사이의 인간 발달 기간을 설명합니다. 마지막으로 인간이 어떻게 구성되는지 이해하기 위한 토대를 마련하는 hPSC 기반 3D 모델을 사용한 선구적인 실험에 대해 논의합니다.

2. 인간 배아 발생의 주요 사건

hPSC 기반 3D 모델을 사용하여 인간의 이식을 넘어선 형태 형성 과정을 연구하는 방법을 이해하려면 먼저 다능성이 배아를 지배하는 기간인 배반포와 배아 전 단계 사이의 계통 지정에 대한 중요한 지점을 식별해야 합니다.

4-8 세포 단계에서 인간 접합체 게놈 활성화 후, 후속 16 세포 분열(수정 후 약 3일, dpf)에서 처음 두 개의 배아 계통: 영양외배엽 및 내부 세포 덩어리(ICM)의 사양이 시작됩니다. .

각 혈통은 특정 전사 인자(TF)의 발현 및 존재에 의해 구별될 수 있습니다. 예를 들어, Cdx2(꼬리형 호메오박스 2) 및 Gata3(GATA 결합 단백질 3)은 영양외배엽 마커인 반면, Oct4(옥타머 결합 전사 인자 4)는 ICM에 대한 마커입니다. 정점-기저 분극화 과정은 영양외배엽 또는 ICM을 향한 인간 할구의 운명을 나타내는 것으로 밝혀졌습니다. 정점 영역에서 PARP 메신저 RNA의 축적에 따른 F-액틴의 증가는 인간 배아에서 극성화 세포를 정의합니다. 상실배 단계의 시작에서 모든 할구는 GATA3를 발현하지만 압축 및 분극이 끝나면(4 dpf) 정점 도메인이 있는 세포만이 이 전사 인자의 발현을 유지하고 영양외배엽의 전구 세포가 됩니다.

대조적으로, 무극성 세포는 정단 도메인에서 분리되어 GATA3 발현을 상실한 후에 ICM의 전구 세포가 될 것입니다[8]. 그런 다음 배반포와 같은 공동이 압축 및 분극화 과정 전반에 걸쳐 나타나 배반포 단계(5dpf)의 시작을 나타냅니다. 6–7 dpf에서 배반포는 trophoblast, epiblast 및 hypoblast (원시 내배엽이라고도 함)의 세 가지 계통으로 구성됩니다. 후자의 두 개는 ICM[9]에서 파생됩니다.

특정 NANOG(고대 게일어 Tir na nÓg, 아일랜드 신화의 젊음의 땅) TF는 상배엽을 식별할 수 있는 반면, GATA4 및 GATA6는 하배엽(GATA 결합 단백질 4 또는 6)을 식별할 수 있습니다. 흥미롭게도, ICM에서 이러한 계통의 분리는 마우스에서 FGF/ERK2(섬유아세포 성장 인자 및 세포외 신호 조절 키나아제 2) 신호 경로에 의해 조절됩니다[10]. 그러나 인간에서 그것의 억제는 epiblast 또는 hypoblast를 구성하는 세포의 수를 변화시키지 않으며, 이는 FGF/ERK2 경로가 이러한 계통의 사양에 소모될 수 있음을 시사합니다[11,12].

단일 세포 RNA 시퀀싱 기술(scRNA-seq)은 이제 계통 사양을 조절하는 가능한 분자 메커니즘을 밝힐 수 있습니다. Meistermannet al. 인간 상실배와 배반포(3–7 dpf)의 pseudo-time scRNA-seq 분석을 수행하고 배반포의 세 계통에 대한 세포의 궤적을 예측했습니다[13]. 그들은 후배엽의 성숙을 위해 상배엽과 영양외배엽 사이에 상호작용이 있다고 제안했습니다. 생쥐에서 이식 부위 내의 배반포 접착은 성숙한 벽화 영양외배엽(상피배엽 반대편에 위치)에 의해 매개되는 반면, 인간에서는 외배엽에 인접한 영양막 영역(극이라고 함)이 자궁내막에 부착됩니다. 따라서 인간과 다른 영장류에 특유한 사건인 성공적인 착상을 위해 극성 영양외배엽과 외배엽 사이의 상호작용이 필수적인지 여부는 알 수 없습니다.

Blastocyst 형성은 trophectoderm 및 hypoblast와는 반대로 epiblast에 의해서만 소유되는 재산인 pluripotency의 시작을 정의합니다. 다능성은 전통적으로 생식계열과 함께 3개의 배아 층(내배엽, 중배엽 및 외배엽)을 구성하는 모든 세포 유형으로 분화하는 세포의 능력으로 정의됩니다[15]. 그러나 이 잠재력은 태반 및 융모막과 같은 배아외 조직의 형성을 포함하지 않습니다. 그럼에도 불구하고 이 제한은 인간 만능 줄기 세포가 특정 조건에서 배외 계통으로 분화할 수 있기 때문에 마우스에만 적용될 수 있습니다(다음 섹션 참조). 한편, 마우스 배반포가 약 5 dpf에 이식되면 다능성은 위배 형성이 시작되기 약 하루 전에 지속됩니다(6.5-9.5).

대조적으로, 인간에서는 낭배 형성이 시작되기 전에 이식 후 기간(9–14 dpf)이 더 연장됩니다. 놀랍게도, 양막 상피와 배외 중배엽을 포함한 다른 계통은 착상 동안(수정 후 7.5-8.5일) 영장류 상피세포에서 발생하는데, 이는 마우스 모델에서는 관찰되지 않습니다[4]. 이러한 혈통은 낭배 형성 동안 형태 형성을 준비하고 시작하기 위해 epiblast 또는 다른 혈통에 신호를 전달할 수 있습니다.

Epiblast 세포는 이식 후에도 다능성을 유지하지만 분자 및 형태학적 특성은 출구 다능성 및 위배화에 대비하여 자체적으로 재조정됩니다. 이 단계에서 3개의 배아층과 축 패턴이 형성됩니다. 또한, 신경외배엽과 원시선조(PS)는 각각 상배엽 전방 및 후방 영역에 지정됩니다. PS에서 세포는 중배엽 및 내배엽 계통을 형성하기 위해 상피-간엽 전이(EMT)를 겪게 됩니다[16](그림 1).

그럼에도 불구하고 이식 후 발달 과정은 이전에 언급한 문제로 인해 위배 형성에 대한 정보가 거의 없는 인간의 "블랙 박스"로 남아 있습니다. 2021년까지 인간 낭배 전사체(카네기 7단계에 해당하는 약 16-19dpf의 손상되지 않은 배아 사용)를 처음으로 특성화한 우아한 연구가 epiblast, hypoblast, yolk sac, PS 및 원시 생식 세포(PGC) 및 혈액 생성 내피 전구 세포와 같은 특정 세포 집단[17]. 이러한 예측은 XY 유전자형을 가진 단일 샘플을 기반으로 했지만, 이 연구는 다분화능 출구와 인간 형태 형성 과정에서 배아 및 배아 외 계통의 다양화에 대한 귀중한 통찰력을 제공했습니다.

부정할 수 없이, 이 세트를 Meistermann의 데이터[13]와 통합하여 접합체에서 낭배까지 인간 세포 계통의 개발 경로 개요를 얻을 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 낮은 인간 배아 샘플로부터 차등 유전자 발현 데이터베이스를 사용하여 세포 표적 지도를 구축하였다. 따라서 배아 및 배아외 계통 궤적은 실험을 통해 검증되어야 하는 알고리즘을 기반으로 한 가상의 예측일 뿐입니다.

한 가지 가능한 해결책은 hPSC 모델이며, 특히 배아 줄기 세포(ESC)를 사용합니다.

3. 배아줄기세포와 그 다능성

배아 발달 동안의 다능성은 역동적인 단계인데, 이는 epiblast가 3개의 배아 층을 생성하는 능력을 잃지 않고 이식 전, 도중 및 후에 다른 분자 및 형태학적 변화를 겪기 때문입니다[18,19]. 그럼에도 불구하고 다능성은 일단 낭배 형성이 시작되면 사라지기 때문에 일시적입니다. 이 단계는 특정 세포 배양 조건 하에서 배반포로부터 분리된 세포(ICM 또는 외배엽)의 적응으로부터 ESC 라인 유도에 의해 포착될 수 있습니다.

ESC 라인은 복잡한 발달 및 분화 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공하여 단일 배아 세포가 완전히 형성된 유기체가 될 수 있는 방법을 연구할 수 있도록 합니다. 마찬가지로, 이 라인을 통해 우리는 종마다 다를 수 있는 특정 분자 및 잠재적 개발 프로필을 가진 다능성 단계를 식별하기 위해 덧없는 epiblast 전환에 대해 문의할 수 있었습니다.

최초의 ESC 계통은 1981년 마우스 배반포(mESC)[20,21]에서 얻었고 15년 후 영장류(Macaca mulatta 및 Callithrix jacchus)에서 얻었습니다[22,23]. 몇 년 후, 연구자들은 냉동 과잉 배아에서 hESCs를 얻었고, 적절한 정보를 제공한 기증자의 동의를 얻은 후 조달했습니다[24]. 2007년에 만능성 인자인 Oct3/4, Sox2(SRY-box transcription factor 2), Klf4(Krüppel-like factor 4) 및 c-Myc를 이용한 리프로그래밍 방법을 통해 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSCs)를 얻었다[25 ] (독자를 위한 참고 사항: hPSC라는 용어는 hESC 및/또는 hiPSC를 지칭하는 데 사용됩니다).

mESC와 hPSC 모두의 미분화 단계를 유지하는 데 필요한 적응은 다양하므로 종 간에 외삽할 수 없는 데이터가 생성됩니다. mESCs를 유지하기 위한 첫 번째 접근법은 이질적인 세포 집단(준안정 상태로 명명됨)을 촉진하는 태아 소 혈청을 포함했는데, 이는 마우스 배아 세포 다능성과 분자적으로 일치하지 않는 일시적인 기간이었기 때문입니다[26]. 따라서 mESC를 생체 내 대응 물과 유사한 분자 상태로 유지하기 위해 새로운 실험 세트를 조사했습니다. 이 새로운 실험 세트에는 각각 ERK2 및 GSK3 키나아제(mESC LIF/2i 조건)를 억제하는 백혈병 억제제 인자(LIF) 및 저분자 PD0325901 및 CHIR99021이 보충된 화학적으로 정의된 배지가 포함되었습니다. 이 세트는 이식 전 외배엽의 "순진한" 만능성을 나타냅니다[27,28]. 그럼에도 불구하고, 에피블라스트는 이식 후 다능성을 유지했지만 다른 분자 시그니처("프라이밍된" 다능성으로 명명됨)를 가졌습니다. 그것으로부터 epiblast 줄기 세포 (EpiSCs)가 파생되었습니다 [29,30].

두 상태 사이의 기능적 차이는 키메라 형성 분석을 통해 결정될 수 있는데, 순진한 다능성 세포는 새로운 유기체에 기여하기 위해 배반포로 재통합될 수 있는 반면 프라이밍된 세포는 덜 유능합니다[31].

마찬가지로 후생유전학적 염색질 형태의 차이, X 염색체의 각인 상태, 나이브 또는 프라이밍된 다능성과 관련된 TF 발현[32,33], 프라이밍된 세포에서 우선적으로 해당작용 및 산화적 인산화와 같은 다른 불일치가 문헌에 보고되었습니다. 순진한 [25,34]. 예를 들어, 다른 신호 경로는 미분화 상태를 유지합니다. 순진한 mESC는 2i/LIF에 의존합니다. EpiSC는 FGF 및 Activin/Nodal 경로의 활성화를 필요로 합니다[29,35]. 흥미롭게도 EpiSC와 같은 "전통적인" 조건의 hPSC는 키메라 형성에 기여하지 않습니다. 그들은 미분화 상태를 유지하기 위해 FGF 및 Activin/Nodal 신호에 의존하고 LIF/2i에 반응하지 않는 순진한 다능성과 관련된 TF의 발현이 감소되어 있습니다[30]. hPSC 전사체 분석은 10~14dpf 사이의 이식 후 인간 외배엽의 분자 네트워크와 유사한 분자 네트워크를 표시하며 [36], 프라이밍된 만능성을 시사합니다. 따라서 다양한 성장 인자와 작은 분자를 사용한 순진한 인간 다능성 사냥이 실험실에서 진행 중입니다([18,19]에서 개정됨).

앞서 언급한 바와 같이 순진한 hPSC는 순진한 mESC와 비교하여 불일치하는 잠재력을 보여줍니다. 전자는 KRT7(케라틴 7), TFAP2C(전사 인자 AP-2 감마), TEAD4(TEA 도메인 전사 인자 4) 및 GATA3와 같은 영양막 마커를 표현하고 특화된 세포(특히 융모외 영양막, 합포체영양막)로 분화합니다. "자발적" 분화 또는 인간 영양막 줄기 세포 유래[2,37,38].

Naive hPSCs는 Nodal, WNT 및 LIF 경로를 통해 hypoblast 또는 원시 내배엽(PDGFRA, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 알파, GATA6, GATA 결합 단백질 6 및 NID2, nidogen 2)과 관련된 마커가 있는 세포를 생성합니다. . 대조적으로, 순진한 mESC는 영양막 또는 저배엽 계통으로 분화할 수 없습니다. 따라서 인간의 만능성 개념은 3개의 배아 층의 파생뿐만 아니라 배외 계통을 포함하는 더 넓은 잠재력을 언급하면서 변경되어야 합니다. 인간 다능성의 이 뛰어난 가소성은 배반포 및 기타 발달 단계와 유사한 3D 구조를 생성하는 기반 중 하나이며, 이에 대해서는 다음 섹션에서 설명합니다.

4. 줄기 세포를 이용한 인간 배아 발달 모델링 - 생명의 빌딩 블록

지난 40년 동안 hPSCs 및 mESCs의 만능성 및 체외 분화에 대한 지식은 개발 중 신호 및 전사 메커니즘에 대한 이해를 제공했습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 실험은 피더 레이어 또는 합성 매트릭스에서 성장하여 2D 배양 조건에서 수행되었습니다. 배아 발달의 맥락에서 세포는 세포 간 또는 세포와 세포외 기질(자가분비 또는 병치액), 성장 인자 및 모르포겐(주변분비)과 같은 분비 분자 및 기계적 힘(기계적 변환) 간의 상호작용을 포함하여 다양한 유형의 신호에 반응합니다. 이러한 신호는 다양한 축을 따라 배아의 다른 계보와 조직을 설정하는 데 도움이 됩니다. 따라서 생체 내 배아에서 관찰되는 복잡성은 시험관 내 2D 모델에 없습니다.

그럼에도 불구하고, 분화 메커니즘은 다능성 계통에 내재되어 있으며, 생체 내 대응물과 유사한 보다 강력한 조직으로 유도하는 환경을 설계하기만 하면 됩니다. 실제로, hPSC와 mESC 모두 낮은 접착 조건에서 pluripotency를 유지하기 위한 신호 없이 시드될 때(hPSC의 경우 FGF2, mESC의 경우 2iL 철회), 그들은 자발적으로 분화하고 배아체라고 하는 집합체를 형성합니다. 3개의 배아 층으로부터 분화된 세포[40]. 그러나, 조직 구조가 일관되지 않고 이질적 특성으로 인해 배아체는 인간 형태 형성 및 배아 발생에 대한 정보를 거의 제공하지 않습니다.

3D 지향 분화 프로토콜은 hPSC 구조로부터 오가노이드를 확립했으며, 이는 그들이 닮으려는 특정 조직 또는 기관과 유사한 조직을 가지고 있습니다[41,42]. hPSC의 주목할만한 특징은 3D 배아와 유사한 구조를 생성하기 위해 자가 조직화된다는 것입니다[43]. 배아외 조직을 포함한 모든 배아 구조를 나타내는 모델을 "통합 모델"이라고 하는 반면, 양막 형성 또는 체세포 형성과 같은 특정 사건에 초점을 맞춘 모델을 "비통합 모델"이라고 합니다[44]. 전체 배아 발달을 요약하여 실행 가능한 배아를 형성할 수 있기 때문에 윤리적 및 입법적 고려 사항(이 검토의 마지막 섹션 참조)으로 인해 통합 모델과 비통합 모델을 구분하는 것이 필수적입니다. 그러나이 진술은 어떤 실험실에서도 입증되지 않았습니다.

5. 통합 3D 배아 모델

5.1. 인간 포배양

Wu의 그룹은 배반포 생성의 선구자였으며, 여기서 hPSC는 나이브 조건(2i/LIF + 액티빈 및 FGF2)에서 유지된 다음 나이브 및 영양막 배지에서 표피 성장 인자(EGF)와 1:1 비율로 배양되었습니다. WNT 경로 분자(CHIR99021), ALK5 수용체의 두 가지 억제제(A-83 및 SB-431542) 및 히스톤 데아세틸라제 억제제(발프로산). 마지막으로, hPSC는 AggreWell 플레이트의 저배엽 배지(FGF2, Activin A 및 CHIR99021)에서 유지되었고, 저배엽 또는 SOX2 및 KLF17(Krüppel-유사 인자 17)은 외부 영양막 유사 세포(GATA3, CDX2 및 TFAP2C 양성)로 둘러싸여 있고 눈에 띄는 공동이 있는 상배엽을 인식합니다. 특히, 블라스토이드 생성 효율은 10%에 불과했습니다[36].

Liu와 협력자들은 블라스토이드(iBlastoids, 소스가 hiPSC였기 때문에)를 성형하는 또 다른 방법을 보고했습니다. Yu 등과는 달리 그들은 인간 섬유아세포를 Oct4, Klf4, Sox2 및 c-Myc로 재프로그래밍했습니다. 21일 후, 세포는 CDX2 및 GATA2(영양아세포), NANOG 및 OCT4(에피블라스트) 및 SOX17 및 GATA6(하아세포) 양성인 3D 응집체를 형성했습니다. 효율성은 이전 연구[45]에서 보고된 것보다 11.5%였습니다.

단순히 배아 및 배외 계통을 식별하는 것만으로는 이러한 계통과 관련된 몇 가지 마커만 감지할 수 없습니다. 배반포에 인간 배반포와 일치하는 전사체 시그니처가 있는지 확인하려면 강력한 검증이 필요합니다. 그러나, scRNA-seq 분석은 epiblast, trophoblast 또는 hypoblast로 분류되지 않은 중간 집단의 존재를 밝혀냈으며, 이는 이들이 리프로그래밍 방법의 인공물일 수 있음을 시사합니다. 또한, 인간 배반포와 배반포의 영양막 세포는 여러 마커를 공유하기 때문에 양막 세포와 유사한 정체성을 공유합니다[46]. 요약하면, 인간 배반의 첫 번째 물결에는 한계가 있으며 배아를 정확하게 표현하기 위해 모델을 개선할 필요가 있습니다.

5.2. 이식 연구를 위한 블라스토이드

착상 동안, 자궁내막은 "수용성"이 되어 배아의 부착을 허용하므로 어떠한 변화도 착상 실패(영양배엽 세포가 자궁내막을 침범할 수 없을 때) 또는 자연 유산(배아가 성공적으로 착상되지만 자궁과 자궁 내막 사이의 경계면)을 유발할 수 있습니다. 태반과 자궁내막이 파괴됨). 생체 내 이식은 언급된 문제로 인해 연구하는 것이 실질적으로 불가능하기 때문에, 이 중대한 사건 동안 세포 및 분자 과정을 조사하는 대안으로 배반이 나타났습니다. Kagawa와 공동 작업자는 이식 모델의 윤곽을 그리기 위해 인간 배반을 생성했습니다. hPSC는 순진한 상태를 유지하기 위해 LIF 및 ERK2(PD0325901), WNT(XAV-939) 및 PKC(Gö 6983) 경로 억제제와 함께 배양되었습니다. 그런 다음 세포를 LIF 및 ALK5 수용체(TGF-ß/Nodal 경로, A 83-01), Hippo 경로(1-oleoyl-lysophosphatidic acid), ERK 경로(PD0325901) 및 ROCK 키나제(Y-27632) 억제제로 배양했습니다. 약 70%의 효율로 블라스토이드를 설계합니다. Blastoids는 이전에 에스트라디올과 프로게스테론으로 자극되어 접착 및 모방 이식에 성공했던 자궁내막 세포층(선 상피 세포)에 침착되었습니다. 놀랍게도, 포낭은 수용성 자궁내막층에만 부착된 반면, 호르몬 자극을 받지 않거나 레보노르게스트렐(성교 후 피임약으로 사용되는 합성 프로게스틴)으로 치료되지 않은 실험 조건에서는 이식에 실패했습니다.

또한 영양막 계통(trophospheres)만 포함하는 응집체는 자궁내막층에 부착할 수 없으며 극성 영양외배엽으로 성숙할 수 없습니다[47]. 따라서 우아하고 비교적 간단한 일련의 실험에 의해 입증된 바와 같이, 배아 발달 연구에 있어 상피세포와 영양막 세포 사이의 상호 작용을 밝히는 것이 필수적입니다. 또한 아방가르드 모델은 추후 논의될 정확한 이식이나 병리학적 상황에 관여하는 외인성 요인과 분자를 연구하는 플랫폼이 될 수 있다.

5.3. 이식 후 모델로서의 인간 배아

영장류에서 착상 후 상피세포는 양막과 배아 디스크로 분리됩니다. 후자는 균일한 형태를 표시하고 전후방 축(대칭 파열)을 따라 편광됩니다. 우리는 이전에 PS가 배아 형성의 시작에 해당하는 epiblast-embryonic disc의 가장 뒤쪽 부분에서 시작한다고 언급했습니다. 그럼에도 불구하고 인간 상피세포에서 대칭성 파열은 어떻게 이루어지나요? 마우스에서 extraembryonic ectoderm 및 anterior visceral endoderm (AVE)은 전후 지역화에 필수적인 역할을 합니다. 그러나 우리는 이러한 신호가 인간의 영양막, 양막, 하배엽, 배아외 중배엽 또는 이들 모두에서 기원하는지 알 수 없습니다[9].

순진한 세포와 ​​프라이밍된 세포가 각각 착상 전 및 착상 후 외배엽을 나타낸다는 전제 하에 Simunovic과 공동 작업자는 12dpf에서 착상 후 배아를 에뮬레이트하기 위해 프라이밍된 hPSC로 3D 모델을 설계하고 대칭 파열과 관련된 신호를 감지했습니다[48]. 프라이밍된 hPSC는 1) 3D 하이드로겔 배양에서 에피블라스트 유사 회전 타원체 및 2) BMP4(골 형태 형성 단백질 4) 및 FGF2로 유도하여 배외 유사 세포(xEM)를 형성하도록 유도되었습니다. xEM 유래 세포 전사체는 영양막(KRT7, GATA3, GATA2), 양막(WNT6 'wnt family member 6,' ISL1 'ISL LIM homeobox' 및 GABRP 'gamma-aminobutyric acid type a receptor subunit pi')의 아말감과 extraembryonic mesoderm (GATA6, VIM 'vimentin' 및 COL6A1 'collagen type VI alpha 1 chain') 마커[48]. 두 세포 그룹 모두 저부착 플레이트(300-500 xEM 세포가 있는 1개 또는 2개의 외배엽 유사 낭종)에 통합되어 "배아"라고 명명된 구조를 생성했습니다. 놀랍게도, 배아의 절반은 착상을 시뮬레이션하여 부착할 수 있었고 편평 상피(양막) 및 외배엽 유사 세포에 인접한 GATA6+ 세포(하배엽)로 둘러싸인 원주형 상피(OCT4 및 NANOG 양성, 외배엽)를 보여주었습니다. 또한 그들은 이식 중에 융합체를 형성하기 위해 침입한 GATA2+/GATA3+(영양아세포) 세포의 외층을 발견했습니다. 배양 2-4일 후, 배아는 BRACHYURY 및 NANOG가 각각 후방 및 전방 부분에 있는 비대칭 발현을 보였으며, 이는 BRACHYURY 양성 영역으로의 대칭 파열 및 PS 출현을 시사합니다. scRNA-seq는 MIXL1(mix1 paired-like homeobox), WNT8A(wnt family member 8A), MESP1(mesoderm posterior BHLH transcription factor 1) 및 PDGFRA 발현을 통해 측면 중배엽 전구체의 추정 하위 집합과 함께 PS의 존재를 확인했습니다. (FOXF1 '포크헤드 박스 F1', KDR '키나제 삽입 도메인 수용체') 및 근축 중배엽(CDX1, CDX2).

한편, 추정 영양막은 세포영양막(EGFR '표피 성장 인자 수용체', BCAM '기초 세포 부착 분자', YAP1 'yes1 관련 전사 조절인자'), 융모외 영양막(ITGA2' integrin subunit alpha 2', TPM1 'tropomyosin 1', NOTCH 'neurogenic locus notch homolog protein') 및 성숙한 극성 영양외배엽(NR2F2 'nuclear receptor subfamily 2 group F member 2') [48]. 마지막으로, 배아는 AVE 혈통 마커를 발현하지 않았으며, 이는 인간의 외배엽 지역화/비대칭이 마우스에서와 같이 AVE에 의존하지 않음을 시사합니다.

따라서 이 원형은 영장류의 특정 이식 후 메커니즘(예: PS 형성을 촉진하는 신호 계층 구조 및 기관 형성 동안 세포 운명 사양의 기초가 되는 규칙)을 설명할 수 있습니다.

5.4. 최초의 자궁외 합성 배아

이전에 통합된 3D 배아 모델은 낭배가 시작될 때까지 인간 배아 발달의 초기 단계를 나타냅니다.

다음 과제는 3D 모델로 조립된 전신 계획을 사용하여 유기체 형태 형성을 요약하는 것입니다. 현재 연구는 미래에 줄기 세포를 사용하여 합성 인간을 구축하기 위한 지식을 개발하기 위해 쥐 줄기 세포를 사용하는 데 주로 초점을 맞추고 있습니다.

이러한 "합성 배아"를 얻는 데 있어 주요 문제 중 하나는 배아 발달 동안과 마찬가지로 시험관 내에서 서로 다른 세포 유형 간의 상호 작용이 부족하다는 것입니다. 예를 들어, 내장 내배엽은 배아를 "후방화"하는 신호를 억제함으로써 상배엽의 전후축 생성에 중요합니다. 실제로, extraembryonic 내배엽을 생성할 수 있는 제한된 잠재력으로 인해 extraembryonic endoderm(XEN) 줄기 세포는 배아 유사 구조 형성에 기여하는 제한된 능력을 가지고 있습니다. Zernicka의 그룹은 영양막 줄기 세포(trophoblast stem cell, TSC), 마우스 배외 배아 내배엽 줄기(extraembryonic endoderm stem, XEN) 및 mESC 공동 배양에서 확립된 배측 및 전후방 축으로 6.5 마우스 단계에 해당하는 배아 유사 구조를 도출했습니다. 또는 GATA4 과발현이 있는 mESC에서 XEN 유도(iXEN)에 의해 XEN 라인을 전환합니다[49]. 그러나 그들은 이 단계를 넘어서지 못했다.

한편, Hanna의 그룹은 이식 후 마우스 배아의 자궁외 배양을 위한 회전식 배양 시스템을 설계했습니다. 그들은 팔다리가 형성되기 시작하는 5.5일에서 11일 단계까지 배아의 발달을 보고했습니다[50].

또한, 그들은 회전 배양과 Zernicka의 재프로그래밍 방법을 통해 최초의 줄기 세포 기반 "합성 배아"를 얻었습니다. 그들은 순진한 유도성 Cdx2 및 Gata4 mESC(각각 iGata4 및 iCdx2 mESC)를 얻기 위해 순진한 ESC에서 Cdx2 및 Gata4를 과발현시켰으며, 이들은 [51]에서 형질도입되지 않은 순진한 ESC와 함께 배양되었습니다.

차례로 Zernicka 연구실은 가짜 배아를 얻기 위해 Hanna의 생물 반응기에서 줄기 세포를 배양했습니다. 한 연구에서 mESC는 TSC 및 iXEN(ETiX)[52]과 함께 배양되었으며, 다른 보고서에서는 2개의 배외 계통이 mESC에서 재프로그래밍되어 3개의 외배엽 유사, 영양외배엽 유사 및 배외 내배엽 유사 계통(EiTiX ) [53]. 이러한 연구는 5.5와 8.5dpf 사이의 마우스 발달을 반복하는 post-gastrula 배아의 전후방 및 dorsoventral 축으로 정렬하기 위해 응집체가 어떻게 자기 조직화되었는지 설명했습니다. 배아와 유사한 집합체는 배아 외 막 구성 요소(난황낭 및 양막)와 8.5일의 마우스 배아와 같은 기관 형성을 시뮬레이션하는 구조(신경관, 함입 앞장, 체절 및 심지어 뛰는 심장)가 있는 배아 구획을 가졌습니다. 따라서 그들은 합성 배아라고 불렀습니다. 그러나 이들은 EPC(ectoplacental cone cells) 및 TGC(trophoblast giant cell)와 같은 extraembryonic ectodermal lineages가 부족하다[52,53]. 그럼에도 불구하고 쥐의 줄기 세포로 수행된 이 매혹적인 실험은 자궁에서 자라는 가짜 유기체의 발달 과정을 관찰함으로써 실험 발생학의 이정표를 추적합니다. 다음 과제는 hPSC에서 합성 배아를 유도하기 위한 조건을 설계하는 것입니다.

6. 통합되지 않은 3D 배아 모델

6.1. 양막 형성 3D 모델

영장류에서 상피세포의 아집단은 상피화 과정을 거쳐 궁극적으로 양막강을 발생시키는 편평 세포의 상피를 형성합니다. 한편, 중피 세포는 영양막 영역의 양막 상피를 덮어 두 층 사이를 제한합니다. 대조적으로, epiblast는 hypoblast 가장자리를 따라 pluripotent로 남아 배아 디스크 [9]로 알려진 columnar pseudostratified epithelium을 형성합니다.

epiblast에서 인간 양막 상피 세포 (hAEC) 분화에 관련된 분자 및 세포 메커니즘은 알려져 있지 않습니다. 그들의 기원의 중요성은 몇 가지 이유에 근거합니다. 재생 의학에서 hAEC는 만삭 태아 막에서 분리될 때 다능성 관련 마커를 제시하기 때문에 줄기 세포의 가능한 공급원입니다. 따라서 그들은 epiblast [54]를 상기시키는 것으로 간주될 수 있습니다. 이전에 언급한 바와 같이, 이식 후 외배엽은 계속해서 다능성입니다. 그러나 이 기간 동안 초기 양막과 상호 작용한다는 점을 고려해야 합니다. 따라서, epiblast 지역화 및 형태 형성에 대한 관문으로서, 이 상호 작용은 영장류의 철저한 다능성 스펙트럼을 잠복시키는 공식입니까?

Fu의 그룹은 양막이 다능성 세포에서 파생된다는 것을 증명했습니다. 그들은 양막 시작을 유도하기 위해 BMP4 구배로 이식 틈새를 모방하는 3D 생체 재료 시스템에서 hPSC를 배양했습니다. 자가 조직화가 가능한 세포는 내강(PASE, 이식 후 양막 배아라고 함)과 원주 상피(추정 상피세포)가 있는 비대칭 배아 낭종을 유도한 반면, BMP4에 노출된 대극은 TFAP2A(전사 인자)를 생성했습니다. AP-2 α)양성 편평세포로 양막상피를 고려하였다[55,56].

아직 불분명한 또 다른 초기 발달 사건은 영장류의 PGC 결정입니다. 짧은꼬리원숭이 배아에서 첫 번째 PGC 마커(SOX17, TFAP2C 및 BLIMP1 'B 림프구 유도 성숙 단백질-1')는 등쪽 양막에 인접하여 제한되며, 이는 BMP4 및 WNT3와 같은 배아 유도와 관련된 모르포겐을 추가적으로 발현합니다. 영장류 PGC는 양막에서 지정됩니다[57,58]. 따라서, 이식 동안, 후방 상피세포는 양막 또는 PGC와 같은 계통을 유도하는 데 더 능숙할 것입니다(배아 층의 삼합체에 더하여). 이것은 "germline pluripotency"로 알려져 있으며 영장류에만 해당됩니다[59]. 흥미롭게도 PASE 모델에서 epiblast-like 구조에 해당하는 극은 후방 지역화(PS 시뮬레이션)를 획득하고 일부 세포는 TFAP2C+/SOX17+이며 이는 PGC의 형성을 나타냅니다[56]. PASE는 양막형성의 연구뿐만 아니라 후방 상피세포에서 직접 파생되거나 상피세포가 양막 및 PGC를 향한 혈통의 분기점을 가지고 있는 생식계열에 필요한 신호를 설명하기 위한 대체 모델이라는 점에 유의해야 합니다. 또는 epiblast를 통해? 양막? PGC 궤적.

Fu 연구실의 가장 최근 작업에서 그들은 단일 세포 RNA 분석을 통해 PASE 모델의 epiblast에서 다양화되는 계통의 궤적을 추적했습니다. Epiblast-like cells(EPiLC)은 원시 줄무늬 세포, AMLC(amniotic-like cells) 및 PGCLC(primordial germinal cell-like cells)를 유도하기 위해 분지된 반면, 생식계열 기원을 탐구하는 것은 AMLC 및 PGCLC로 분기된 초기 AMLC 집단을 보여주었습니다. 60]. 이러한 결과는 영장류에서 PGC가 외배엽 또는 원시 줄무늬에서 직접 파생되지 않음을 시사합니다. 대신, 그들은 양막과 PGC 모두에서 파생되고 "배엽 다분화능"을 나타내는 상배엽의 하위 집단에 대한 아이디어를 지지합니다.

6.2. 인간 Gastruloids의 형성

낭배 형성 과정은 생쥐와 인간에서 각각 6.5dpf와 16dpf에서 시작하며, 이 기간은 신체 계획이 수립되는 기간입니다(특히 전후방, 배쪽 등). 분화 및 형태학적 파트너십은 배아의 축 조직 내에서 공간적 위치를 모델링하기 위해 삼자 배아 혈통을 이끈다. 포유류에서 낭배 형성은 PS의 형성으로 시작됩니다. 중배엽 및 내배엽 전구체는 PS를 통해 이동하여 EMT를 겪고 중배엽 및 내배엽 층으로 파생됩니다. 또한, EMT-회피 상피 상피세포는 신경판 및 표피와 같은 외배엽 계통을 형성한다[43]. 생쥐에서 낭배 형성은 AVE, PS 및 배아 외 외배엽 경로 신호에 의해 지배됩니다. 후자는 trophectoderm에서 파생됩니다.

배외 외배엽은 BMP 경로를 통해 내장 내배엽을 유도합니다[61]. 결과적으로 전방 부분모집단(AVE)은 BMP/결절 및 WNT 경로 길항제를 통해 전방 상피세포가 "후방화"되는 것을 차단합니다[62,63]. 따라서 PS의 중배엽 형성은 후방 상피세포에서 제한됩니다. 언급한 바와 같이 시험관 내 인간 외배엽의 대칭 파괴는 어떤 실험적 접근으로도 입증되지 않았지만 아마도 xEM 계통과의 상호작용에 의해 배아체로 모델링되었습니다[48]. 그럼에도 불구하고 낭배 형성을 유발하기 위해 xEM 계보를 통합할 필요는 없습니다. 실제로 Moris와 공동 작업자는 hPSC의 3D 집합체인 위체체를 생성했습니다. 이러한 낭배체는 포유류의 낭배와 비슷한 전후방 축을 따라 대칭 파괴 및 중배엽 분화 패턴을 나타냈습니다. 그들은 CHIR99021(WNT 경로 분자 활성화)로 24시간 전처리를 수행했습니다. 이어서, 세포를 부유 조건에서 배양하여 응집체를 형성하였다. 흥미롭게도, 골재 가공된 길쭉한 구조는 정확한 공간 패턴으로 96시간에 최대 크기에 도달했습니다. 첫째, BRACHYURY+, 그 다음 SOX17+, 마지막으로 SOX2+ 도메인으로 중배엽, 내배엽 및 외배엽 계통의 지역화를 제안했습니다. , 각각 [64].

BRACHYURY가 발생한 부위가 위체의 가장 후부라고 가정하면, CDX2 및 CYP26A1(cytochrome P450 family 26 subfamily A member 1)과 같은 다른 PS 마커가 확인되었습니다. 흥미롭게도, 위체는 또한 "후방" BRACHYURY, CDX2 및 LNFG(미치광 변두리), MESP1 및 MESP2의 짧은 도메인, MEOX1(mesenchyme homeobox) 및 TCF15(전사 인자 15) 유전자. 이러한 somitogenesis 특징은 gastruloids가 20-24 dpf에 해당하는 Carnegie stage 9 embryo morphology를 나타낸다는 것을 시사합니다[64]. 그러나 추정 PS의 반대 영역에서는 전방 신경외배엽 발달과 관련된 유전자 발현은 검출되지 않았으나 KDR(kinase insert domain receptor), MEIS1(meis homeobox 1), MEIS2(meis homeobox 2), PBX1(PBX homeobox), TWIST1(Twist 계열 BHLH 전사 인자 1), IRX1, IRX2 및 IRX3(iroquois homeobox 1, 2 및 3). 유사하게, Simunovic 배아 모델에서는 신경 유도 마커가 검출되지 않았지만 대칭 깨짐 및 PS 개시가 기술되었습니다[64]. 따라서, 낭배형성의 시작을 모방하는 3D 모델(위배양체 및 배아체)은 신경판과 같은 전방 영역을 통합하지 않습니다.

6.3. 인간의 3D 신경화

Neurulation은 gastrulation이 끝날 때 시작됩니다. 등쪽 외배엽은 신경 외배엽으로 지정되며 상피로 표시된 신경판을 전문으로 하며 생쥐와 인간에서 각각 약 7.5dpf 및 18-20dpf로 나타납니다. 그런 다음 신경판의 측면 가장자리가 안쪽으로 접혀 신경관으로 변형되어 전체 중추 신경계를 발생시킵니다[65]. 흥미롭게도 검토된 각 모델에서 신경외배엽의 전방 구조 형성과 관련된 유전자의 발현이 없었습니다. Krazburn과 협력자들은 hPSC에서 파생된 3D 신경관 카피캣이 약 20-24dpf에서 카네기 8단계의 측면을 재현한다고 보고했습니다. 이 프레임워크에서 세포는 신경 유도를 위해 TGF-ß 억제제(SB-431542)와 함께 2D로 배양된 다음 BMP4가 외배엽의 신경 및 비신경 계통의 지역화 패턴을 촉진했습니다. 합성 세포외 기질(Matrigel)은 2D에서 3D로의 전환을 강제하여 루멘(신경관과 같은) 주위에 상피를 배열합니다. homeobox 2), EMX2(empty spiracles homeobox 2), SIX3(six homeobox 3)], 비신경 외배엽[ECAD(E-cadherin), GRHL3(grainyhead like transcription factor 3) 및 GATA3], 표피 분화[ANXA1–3 (annexin 1-3) 또는 KRT8/18/19(케라틴 8/18/19)], 신경 능선 전구체 및 이동 세포[SOX10(SRY-box transcription factor 10), FOXD3(forkhead box 3), SNAIL1/2( snail family transcriptional repressor 1/2), TWIST1(twist family BHLH transcription factor 1)], 망막 전구체[SOX4(SRY-box transcription factor 4), PITX2(paired like homeodomain 2) 및 FOXE3(forkhead box E3)] 마커에 속하는 신경관으로 확인되었다[66]. 이러한 데이터는 인간의 시험관 내 신경관 형태형성을 입증하는데, 이는 신경관 결손이 발달에 심각한 결과를 가져오고 가장 흔한 선천적 장애(임신 1,000건당 1건)에 속하기 때문에 관련이 있습니다[67].

6.4. 인간 소미토이드

Somitogenesis는 또한 근축 중배엽의 일시적 블록이 척추, 갈비뼈 및 골격근으로 분화되는 신경 단계에서 시작됩니다. 인간의 체세포 생성은 5-6시간마다 피크를 갖는 진동 분자 메커니즘인 분할 시계에 의해 제어됩니다[68]. Sanaki-Matsumiya et al. 최근 전후방 축을 따라 조직된 체절 유사 구조를 포함하는 오가노이드의 생성을 보고했습니다. hPSCs는 FGF2, CHIR99021, SB-431542의 칵테일 및 BMP 경로(DMH1)의 억제제로 처리되어 48시간 동안 체세포 전 중배엽의 운명을 유도했습니다. 세포 응집체는 신장되었고 체절 전 중배엽 세포로의 분화는 TBX6(T-박스 전사 인자 6), HES7(Hes Family BHLH 전사 인자 7) 및 LFNG 발현으로 확인되었으며, 여기서 체절 유사 세포 블록 쌍이 "발아"되었습니다. ; 이들은 FOXC2(포크헤드 박스 C2), MEOX1 및 TFC15 양성이었습니다. 흥미롭게도, 소위 "소미토이드(somitoid)" 구획은 rostrocaudal 및 dorsoventral 극성을 나타냅니다. 저자는 측면 플레이트의 신경관, 척색 및 중배엽과 같은 전체 신경에서 유도 신호를 통합하기 위한 실험적 요구를 강조했습니다(그림 2).

7. 임상 연구에서의 3D 배아 모델

태아 리프로그래밍에 따르면, 많은 병리학이 초기 배아 발달 동안 손상되고 출생 후 또는 성인 단계까지 나타납니다. 인간 발달에 대한 우리의 이해는 다른 종의 배아 분석에서 추론할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 언급한 바와 같이, 배외 혈통 출현(양막 상피 및 배외 중배엽)과 같은 영장류의 정교한 사건은 고전 모델(Danio rerio, Xenopus laevis, Gallus gallus, Mus musculus)에서 얻은 지식을 외삽하는 것을 허용하지 않습니다. . 또한 인간 발달 단계에 대한 자세한 데이터는 몇 가지 또는 단 하나의 표본(예: 단일 낭배의 전사체)에서 나옵니다.

자궁 상피에 대한 인간 배반포 접착과 같은 다른 이정표는 배반포에 대한 시험관 접착 실험 설정까지 접근할 수 없었습니다. 그러나 이러한 실험은 일상적으로 해결될 수 없습니다. 전 세계적으로 단 두 개의 연구 그룹만이 이 현상을 검증했습니다. 이제 hPSC에서 파생된 3D 모델의 합성 생물학을 통해 처음으로 달리 관찰할 수 있을 뿐만 아니라 이식 전과 이식 후 사이의 시간 창을 조작할 수도 있습니다.

따라서 불임 및 조기 임신 손실과 관련된 착상 및 태반 문제를 암시하는 질병을 모델링하는 것이 가능합니다. 출산율은 30%이고 50-60%만이 임신 발달을 계속하는 반면, 중단된 임신의 75%는 착상 실패로 인한 것입니다[70]. "성공적인" 이식에는 호르몬, 사이토카인 및 성장 인자, 비코딩 RNA(miRNA 및 lncRNA), 후생유전학적 복합체와 같은 수많은 분자 구성 요소에 의해 조정되는 8~9dpf 사이의 배반포와 수용성 자궁내막 사이의 "맞춤형 대화"가 필요합니다. , 면역학적 요인 및 세포외 기질 성분. 10dpf에서 배반포는 기질에 내장되었고 단핵 세포 영양막은 영양막 층에서 나와 태반 배치를 시작했습니다. 부적절한 침입은 자간전증 및 출혈로 인한 산모 사망과 같은 병리와 관련이 있습니다. 동시에 과도한 침습은 자궁벽의 과도한 태반 성장(점착태반), 자궁근층 위로 확장(점착태반) 또는 심지어 자궁근막을 넘어 확장되어 자궁 장막과 인접 기관(태반 percreta)을 덮을 수 있습니다[70].

반면에 태아 재프로그래밍 교리에 따르면 착상 전후에 발병하는 질병을 이해하지 못합니다. 그럼에도 불구하고 광범위한 역학 연구에 따르면 성인기의 대사 장애(콜레스테롤 및 트리글리세라이드 수치 상승, 체질량 지수 증가) 및 신경정신 장애(정신분열증 위험 증가)의 위험은 불리한 조건(기근, 전쟁 등)에 대한 노출과 관련이 있습니다. 개발 첫 주 동안 [71,72,73,74]. 무뇌증, 이분척추증, 뇌류 및 두개치열증은 신경관 폐쇄 실패로 인해 발생합니다. 마우스 모델에서 200개가 넘는 유전자의 돌연변이가 신경관 결함을 유발합니다. 대조적으로, 히스톤 데아세틸라제 억제제(발프로산 또는 트리코스타틴 A), 엽산 길항제(카르바마제핀, 푸모니신 및 트리메토프림) 또는 고혈당증(잘 조절되지 않는 산모 당뇨병에서)을 포함하는 다양한 비유전적 요인과 함께 다유전자성 또는 소수성 병인, 인간의 위험을 증가시킨다[75,76].

동시에, 척추 분할의 중단은 Alagille 및 Goldenhar 증후군, Klippel-Feil 기형, VACTERL 연관(V: 척추 기형, A: 항문 폐쇄증, C: 심혈관 기형, TE: 기관식도 누공, R: 신장 기형)을 생성할 수 있습니다. 기형, L: 사지 결손), 척추늑골이골증, 선천성 척추측만증, 후만증 및 전만증. DLL3(delta-like canonical Notch ligand 3), PAX1(paired box 1), SLC35A3(solute carrier family 35 member A3), WNT3A(Wnt family member 3A), TBX6, LFNG, HES7 및 MESP2 돌연변이가 이러한 기형에 연루되었습니다. 체세포 형성 동안 배아는 저산소증 및 일산화탄소 노출, 고혈당증(임신성 당뇨병), 고열, 푸모니신, 칼륨 채널의 약리학적 차단제, 페니토인 및 발프로산, 척수에 기형 유발 효과가 있는 제제와 같은 환경 손상에 취약합니다. 개발 [77].

인간의 착상 후 발달 동안 최기형성 인자의 영향을 평가하기 위한 첫 번째 접근법은 Moris et al. (2020). 전 트랜스 레티노산(0.4 nM, 33 nM), 발프로산(4 μM, 333 μM), 보센탄(4 μM, 18 μM), 탈리도마이드(0.4 μM, 100 μM), 페니토인(20 μM), 이부프로펜(63μM, 250μM) 및 페니실린 G(63μM, 1mM, 2mM). 최고 농도의 레티노산, 발프로산 및 보센탄은 크기 감소, 형태학적 변화 및 유전자 발현의 변화(SOX2, 신경외배엽, SOX17, 내배엽, BRACHYURY, 중배엽)를 촉진한 반면, 탈리도마이드와 이부프로펜은 농도에 관계없이 변화를 유도했습니다. 대조적으로, 페니실린이나 페니토인에 대해서는 명확한 형태적 또는 분자적 변화가 관찰되지 않았습니다[78].

요약하면, hPSC에서 파생된 3D 모델은 낭배 형성에서 발생하는 효과 및 이상을 연구하고 다인자 원인(유전자-유전자 상호 작용 또는 유전자-환경 요인 또는 최기형성 인자)을 밝히고 인간의 여러 질병에 대한 가능한 치료법을 밝히는 데 사용됩니다.

8. 3D 배아 모델에 관한 윤리

우리는 현재 인간의 배아 발생 및 형태 형성 메커니즘을 연구하기 위해 줄기 세포 기반 3D 모델 및 고처리량 시퀀싱 플랫폼과 같은 새로운 기술을 통해 생물학에서 전례 없는 시점에 있습니다. 이런 식으로 우리는 수세기 동안 우리에게 닫혀 있던 착상을 넘어선 인간 발달의 연속적인 풍경을 덮고 있는 검은색 페인트의 층을 제거하고 있습니다. 또한 치료 잠재력 수준에서 개발 중 변경에 대한 잠재적 치료법의 안전성과 효과를 평가하고 실행 가능한 솔루션을 제공하는 귀중한 플랫폼이 될 수 있음이 입증되었습니다. 그러나 과학적 진보에는 일반적으로 과학계와 사회 전반에 관련된 다양한 윤리적, 철학적, 심지어 법적 논의가 수반되는 경우가 많습니다. 단 3년 만에 3D 모델과 관련하여 발생하는 주요 윤리적 딜레마를 논의하는 여러 리뷰가 게시되었습니다[79,80,81,82,83]. 예를 들어 동물 실험에서 인간의 3D 배아 또는 오가노이드 모델을 사용하여 기능을 테스트하기 위해 이식 또는 이식이 가능한 경우 윤리적 고려 사항이 있습니다[80].

또 다른 문제는 hiPSC 라인이 파생된 정보에 입각한 동의입니다. 세포 기증자는 일반적으로 hiPSC 기반 3D 배아 구조 생성 및 상용화 가능성에 대해 조언하지 않습니다[79,80]. 3D 모델의 "본질"에 대한 존재론적 질문도 있습니다. 예를 들어 인간의 낭배 또는 신경관의 발달을 가능한 한 가깝게 재현하는 데 사용된다면 어떤 결과가 뒤따를까요? Gastruloids, neuroloids 및 blastoids는 "인공 배아"로 분류 될 수 있습니다. 그렇다면 그들은 일부 공동체가 배아에 부여하는 것과 동일한 도덕적 지위를 갖게 될까요? 더욱이, 합성 마우스 배아에 대한 최근 연구는 세포가 이전에 시험관 내에서 관찰된 적이 없는 복잡성 수준에서 자가 조직화할 수 있음을 입증했습니다. 미래에 줄기세포 유래 배아의 완전한 자궁외 발달이 이루어진다고 가정하면, "자연적" 조건에서 자궁에서 발달한 유기체와 마찬가지로 자율적인 개체로 간주될까요? 따라서 배아가 무엇인지 재정의하는 것부터 시작하여 발생생물학의 여러 개념을 바꿀 필요가 있다. 또한 과학계가 3D 모델을 사용하여 인간 배아 발생을 연구하고 잠재적인 이점을 강조함으로써 과학계가 얼마나 탐구했으며 그 결과를 어떻게 전파해야 하는지에 대한 질문도 있습니다. 부정확하고 불완전한 개념이 있다면, 이 분야에 정통하지 않은 사람들은 우려와 반론으로 이어지는 윤리적 판단을 가질 수 있습니다(예: 피질 오가노이드를 "미니 브레인"으로 "3D 발달하는 신경 조직을 요약한 배양”).

또한 연구에서 윤리적 및 무결성 경계를 정의하는 것에 대한 담론이 있으며, 이에 따라 과학자들은 강력한 연구 관행을 유지하기 위해 과학계 내에서 확립된 계약을 준수합니다. 이 분야의 최근 발전에 비추어 연구. 예를 들어 위배양체의 배양은 14dpf 단계를 초과하지 않는 배아를 연구하기 위해 과학계에서 설정한 기간을 초과하는 18-21일 pf 단계를 회상합니다(이 시나리오에서는 "비슷한 -태아"). ISSCR(International Society for Stem Cell Research) 가이드라인은 2년 전에 업데이트되었으며, 통합되지 않은 hPSC 기반 3D 모델(위배체, PASE 모델, 신경관 형태 형성, 소미토이드, 특정 오가노이드 등)이 다음과 같이 분류되었습니다. 범주 1. 이 범주의 프로젝트는 철저한 수정이 면제되며 기관 연구 및 생명 윤리 위원회의 승인으로 충분합니다. 대조적으로, 14dpf 또는 PS 형성 개시(둘 중 먼저 발생하는 것)까지 배양된 배아와 통합 hPSC에서 파생된 3D 모델(배아 및 배아외 계통(블라스토이드 및 배아양)을 포함하는 것으로 알려진)은 카테고리 2에 속합니다. 이 범주에서 승인이 필요하고 외부 위원회를 포함하여 다양한 연구, 의료 및 생명 윤리 위원회의 조정을 통해 지속적인 전문 모니터링 프로세스를 거치며 현지 법률 및 정책을 준수해야 합니다(https://www.isscr.org/isscr -news/the-isscr-releases-updated-guidelines-for-stem-cell-research-and-clinical-translation(2022년 5월 26일 액세스).

이러한 질문에 대한 응답으로 3D 모델은 방정식의 개별 또는 여러 구성 요소를 제거하거나 변경하여 살아있는 유기체로 발전할 가능성을 방해하도록 의도적으로 설계될 수 있습니다. 요약하면, 인간 배아 발생을 연구하기 위해 3D 모델을 활용하는 것의 잠재적인 이점은 명백하지만 잠재적인 위험과 우려 사항도 주의 깊게 고려해야 합니다.

9. 결론

실험에서 hPSC 기반 3D 모델을 사용하여 인간 배아 발생 및 형태 형성의 "블랙 박스"를 공개하려는 흥미로운 시도를 보고 있기 때문에 오늘날 발생학에서 매혹적인 시간입니다.

그러나 이러한 모델을 연구하는 것과 관련된 윤리적 딜레마를 해결하고 다른 배아 및 배아외 계통의 통합을 허용하는 더 나은 문화 플랫폼을 설계하는 것을 포함하여 몇 가지 과제가 남아 있습니다. 또 다른 문제는 3D 배아 모델에서 수행되는 대부분의 분석이 DNA 또는 RNA 수준 및 생물정보학적 분석에서만 수행된다는 것입니다. 혈통의 시공간적 진행을 분석하기 위해 여러 유전자 클러스터가 유전적 서명으로 확인되었지만 배아의 적절한 발달을 위한 기능적 관련성은 아직 연구되지 않았습니다. 현대 발달 생물학은 재생 의학, 태아 프로그래밍 및 번역 의학의 보조 생식, 조직 생명 공학 및 세포 치료와 같은 뛰어난 인간 건강 응용 프로그램을 통해 다른 연구 분야에 귀중한 잠재력을 제공합니다.

저자 기여

개념화, D.A.-G., W.P., N.E.D.-M. 및 N.F.D.; 쓰기 - 원본 초안 준비, D.A.-G., M.Á.G.-G., G.G.-L., A.M.-J., A.M.-H., W.P., N.E.D.-M. 및 N.F.D.; 쓰기—검토 및 편집, D.A.-G., M.Á.G.-G., G.G.-L., A.M.-J., A.M.-H., W.P., N.E.D.-M. 그리고 N.F.D. 모든 저자는 원고의 출판된 버전을 읽고 이에 동의했습니다.

기관 심사 위원회 성명서

적용되지 않습니다.

정보에 입각한 동의서

적용되지 않습니다.

데이터 가용성 선언문

적용되지 않습니다.

이해 상충

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

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감사의 말

탁월한 기술 지원을 제공한 Alejandra Castilla와 Jessica Norris에게 감사드립니다.

참조

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수치

그림 1: 초기 인간 발달의 중요한 사건. 수정 후 일수(dpf)는 각 배아 사건의 근사치입니다. 1 dpf: 극체가 있는 단일 세포-접합체 단계. 2–3 dpf: 접합체 게놈의 활성화. 3.5 dpf: 상실배 압축 및 첫 번째 계통 사양(영양 외배엽 및 내부 세포 덩어리 쪽으로). 4.0–4.5 dpf: 외배엽(trophectoderm)(연어색) 및 내부 세포 덩어리를 포함하는 초기 배반포, 여기에서 epiblast(자주색) 및 hypoblast(그림자 진달래 분홍색)가 분리되기 시작합니다(두 번째 계통 사양). 5.0–6.0 dpf: epiblast(자주색) 및 hypoblast(그림자 진달래 핑크색) 계보가 설정됩니다. 6.5–7.5 dpf: 양막 형성의 시작으로, 상배엽(자주색)이 로제트 모양으로 배열되어 양막강이 발생하는 내강을 형성합니다. 양막 상피는 epiblast의 하위 집단에서 파생됩니다. 7.5–8.5 dpf: 배아가 착상하는 데 필수적인 극성 영양외배엽(몽블랑 피크 색상)의 성숙. 이 혈통의 성숙을 위해서는 epiblast(가시 보라색) 또는 양막 상피(풍포검 키스 색상)에서 방출되는 가능한 신호가 필요합니다. 14 dpf: 형태형성(gastrulation) 이전에 주요 배아 및 배아외 혈통이 확립됩니다. 영양외배엽은 외부 다핵 합포체영양막(7 베일 색상)과 단핵 세포영양막(천연 봄 색상)으로 분화되었습니다. extraembryonic mesoderm (외부 암초 색상)은 아마도 epiblast에서 발생했습니다. 융모막이 형성되는 배외 외배엽은 도식화되지 않습니다. 상배엽(자주색)은 국소화(전후)되고, 원시조선의 형성이 시작되며(주황색 차 장미색), 원시 생식 세포(귀족 파란색)는 아마도 양막 상피(풍선검 키스 색상)에서 지정됩니다. 18–19 dpf에서 배아의 등쪽 보기: 원시 줄무늬(카이토케 녹색)가 이미 설정되어 배아의 좌우 대칭을 나타냅니다. 전방 상피세포는 신경외배엽으로 분화되며, 여기서 신경판(튤리판 바이올렛 색상)이 발생합니다(배아 발생에서 첫 번째 유도 사건이기 때문에 일차 신경 유도라고 함). 마지막으로 양막(카이토케 녹색)이 배아를 둘러싸고 있습니다. 20 dpf에서 배아의 등쪽 보기: 체절(발색)이 나타나기 시작합니다(체세포 형성). [이미지를 보려면 PDF를 다운로드하십시오]

그림 2: 3D 줄기 세포 기반 구조로 인간 배아 발생 모델링. 인간 다능성 줄기 세포(배아 줄기 세포 및 유도 만능 줄기 세포)에서 파생된 3D 구조는 완전한 배아(배아 및 배외 계통에 의해 통합됨)뿐만 아니라 이벤트(양막 형성, 위배 형성) 또는 특정 구조(신경관)를 재현할 수 있습니다. , somites) 배아의. 배반[36,45,47]은 배반포를 구성하는 3개의 계통을 제시하며, 각각은 특정 유전자의 발현에 의해 식별됩니다(KLF17, NANOG, OCT4 및 SOX2는 epiblast-like 세포(황금색), SOX17 및 GATA6는 배아세포 유사 세포(자주색 쿠시 색상), 영양외배엽 유사 세포(청록색 색상)에 대한 GATA3, GATA2, CDX2 및 TFAP2C. 배아체[48]는 상배엽에 해당하는 원주 상피(privet hedge color)(OCT4, NANOG, SOX2)를 나타냈습니다. extraembryonic-like cells (pluviophile color) (trophectoderm의 경우 KRT7, GATA2 및 GATA3, extraembryonic mesoderm의 경우 GATA6, COL6A1 및 VIM, amnion의 경우 ISL1, GABRP, WNT6)의 혼합으로 둘러싸여 있습니다. 상배엽이 관찰되었고 후극이 BRACHYURY(낙원색)에 양성으로 나타나 원시선조의 출현을 시사하였다. OCT4/TFAP2C(양막과 같은 편평 세포, 자주색 쿠시 색상)에 대해 양성인 반면, 반대 극은 후부 상피세포 유사 세포(BRACHYURY, 눈부신 색상)입니다. 이중 TFAP2C/SOX17 양성 세포는 원시 생식 세포(도토리 너트 색상)의 모양을 나타냅니다. Gastruloids[64]는 전후방 축을 따라 배열된 특정 도메인이 있는 길쭉한 구조로, 3개의 배아 층 각각의 존재를 나타냅니다[중배엽의 BRACHYURY(바다 생물 색상), 내배엽의 SOX17(베고니아 핑크) 및 외배엽의 SOX2(야간 시계) 색상)]. 신경관과 같은 구조[66]에서 외배엽 세포는 신경 계통(전방 신경외배엽, 산호 금색), 비신경 계통(표피, 아스트로터프 색) 및 신경 능선 세포(계획에 표시되지 않음)로 분화됩니다. Somitoids [69]는 somite-like segment 쌍이 발생하는 presomitic mesoderm (TBX6, HES7, 쓴 민들레 색)의 길쭉한 구조입니다. 각 체절 유사 블록은 주둥이 TBX18(고사리 캐노피 색상) 및 꼬리 UNCX4.1(서리 낀 정원 색상) 마커의 교대 표현에 의해 입증된 주둥이-꼬리 조직을 나타냈습니다. [이미지를 보려면 PDF를 다운로드하십시오]

저자 소속:

[1] Cellular Reprogramming and Tissue Bioengineering Laboratory, Medical and Pharmaceutical Biotechnology, Center for Research and Assistance in Technology and Design of Jalisco, Guadalajara 44270, Mexico

[2] 생리학 및 세포 발달과, 국립 주산기학 연구소, 멕시코 시티 11000, 멕시코

[3] 멕시코 국립자치대학교 신경생물학 연구소, Querétaro 76230, 멕시코

작성자 참고 사항:

[*] 서신: ediaz@ciatej.mx(N.E.D.-M.); nfdiaz00@yahoo.com.mx (NFD)

DOI: 10.3390/cells12081192